Q：如何选择合适的克隆载体？

A：Taq系列酶扩增的片段，选用T载体；Pfu系列酶扩增片段，选用Blunt系列载体，也可以加“A”后和T载体连接，但效果不如直接连接Blunt系列载体。如果PCR模板是质粒DNA，推荐使用双抗性载体。

Q：插入片段的量多少合适？

A：

• 片段加入量可根据片段长度不同进行调整。 最佳插入片段DNA量：载体与片段摩尔比=1:7

• 可以粗略的按照“1 kb 20 ng”的比例计算。(如1 kb加20 ng，1.5 kb加30 ng等)、(在胶上通过TransGen的DNA 分子量标准粗定量即可)

• 片段加入量最大为4μl，即使片段浓度很低也不要超过此限。片段加入量最少为0.5μl，可以补充无菌水以方便操作。

• 反应温度范围：20-37℃，最适反应温度为25℃。

Q：反应时间多长合适？

A：

• 大多数1 kb以内的PCR产物室温反应5分钟即可完成反应。以下几种情况可以延长反应时间以获得更理想的效果：

• 具有特殊结构(高AT/高GC/反向重复序列)的片段：10-20分钟。

• 胶回收片段或加"A"片段：10-15分钟(该条件适用于3 kb以内的片段)。

• 大于3 kb的PCR产物需延长至15-20分钟。

Q：连接产物可以保存多久？

A：连接产物可以置于-20℃或2-8℃冰箱，一周内使用。

Q：多克隆位点上的酶切位点切不开？

A：筛选到的克隆来源于模板质粒而不是连接产物。推荐使用双抗载体，筛选时使用模板质粒不具有的抗性。

Q：克隆数少或阳性率低？

A：

• 影响克隆数目和克隆效率的因素有许多，如感受态细胞效率、插入片段质量、基因结构、插入片段长度、插入片段和载体的比例等。如发现克隆数少或克隆效率低，可尝试下列方法：

• 感受态细胞的转化效率对克隆数有重要影响，转化效率高低与连接产物克隆数的多少不呈线性关系。假设细胞转化效率为1×109 cfu/µg DNA时，克隆数为1000；转化效率为1×108 cfu/µg DNA时，克隆数并不是100，而是低于100。为保证克隆数，请选用高转化效率的Trans1-T1感受态细胞。

• 使用新鲜的PCR产物：PCR产物于2-8℃保存，1-2天内使用。对于胶回收产物，应尽量缩短紫外照射时间并适当延长反应时间 (10-15分钟)。

• 目的片段浓度极低时，进行浓缩，以保证反应时分子碰撞机率。

• 毒基因：使用Trans10感受态细胞。

• 具有特殊结构 (高AT/高GC/反向重复序列) 的基因：适当延长反应时间至10-20分钟。

Q：PCR鉴定重组子失败？

A：当用通用引物鉴定重组子，没有得到目的扩增产物，又没有载体自连带，说明PCR失败。重新优化PCR条件或提取质粒，以质粒作模板扩增或酶切鉴定包含重组子的克隆。

Q：重组克隆呈现淡蓝色或“Fish eye”？

A：插入片段没有影响LacZ基因读码框，或插入片段太短 ，这种情况下克隆呈现淡蓝色或“Fish eye”，可正常鉴定。