qPCR检测

实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种研究基因表达量的重要方法，利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。

qPCR重要参数

➣ 扩增曲线

qPCR反应开始时，荧光信号不稳定，呈现波动状态，随后信号会趋于稳定并且呈现指数性增长，到达一定循环数之后，荧光信号强度不再增加，持续稳定。  

扩增曲线展现出来为一条S型曲线，包括：基线期，指数扩增期，平台期。反应完成后，qPCR仪会以基线期荧光信号标准偏差的10倍生成一条阈值线，阈值线与扩增曲线产生交点，交点对应的横坐标代表Ct值，Ct值的含义代表每一个反应体系中荧光信号强度达到阈值时经历的扩增循环数，其本质不难看出就是循环数，它是荧光定量中唯一用于后续计算的数值，是后续定量计算的基础。

➣ 熔解曲线

熔解曲线是指随着温度升高，反映DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线，熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰就可以将特异性产物与其它产物如引物二聚体区分开。

qPCR定量方法

定量方法包括相对定量和绝对定量，两者的重要差异在于相对定量的结果是差异性的结果，涉及比较；而绝对定量的结果是一个具体数值，对于基因表达量而言是基因的拷贝数，不涉及任何比较。

➣ 相对定量

首先需要确定一个内参基因，常用的内参基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA，其本质作用是利用内参基因的Ct值对目的基因的Ct值进行均一化处理。其次，相对定量需要确定参照物，参照物选择不同，所得的定量结果可能完全相反，经常选择的参照物一般是对照组或未处理组。

➣ 绝对定量

首先需要建立Ct值和拷贝数之间的线性关系，即标准曲线，由标准品生成。标准品中基因序列要与待测样品中基因序列一致，从而保证引物在两者中扩增效率完全相同。标曲是由不同梯度标准品生成，落在标曲上的梯度点最好有5个及以上，标准品和待测样品同时反应，将待测样品检测的Ct值代入标曲后即可换算出待测样品中基因的拷贝数。

qPCR检测方法

qPCR最常用的两种检测方法分别为SYBR Green染料法和TaqMan探针法。

➣ SYBR Green染料法

在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green荧光染料，其特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的荧光染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR Green染料法需要注意引物的特异性，因为非特异扩增产物和引物二聚体均为dsDNA，所以该方法只能通过引物来保证特异性。

全式金推出的PerfectStart^® Green qPCR SuperMix采用PerfectStart^® Taq热启动酶，采用3种抗体封闭，有效地封闭了DNA聚合酶活性，阻止了低温下的非特异性扩增。

● 产品特点

✼ 3种抗体封闭，特异性高，灵敏度高，扩增效率强，适用物种范围广。

✼ 双阳离子缓冲液，增强特异性，减少引物二聚体形成，数据准确。

✼ 配有适用于不同机型的Universal Passive Reference Dye (调整PCR加样误差引起的管间差异)，数据准确。

● 3种抗体封闭原理图

● 封闭效果

以不同浓度人gDNA为模板扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PerfectStart^® Taq热启动酶的封闭效果。结果显示，封闭后可显著提高扩增灵敏度和特异性。

以小麦cDNA为模板，qPCR检测PerfectStart^® Taq热启动酶的封闭效果。结果显示，封闭后可显著提高扩增特异性。

● 扩增效率

以梯度稀释的质粒DNA (10 ng-0.1 pg，10倍稀释 ) 为模板进行qPCR扩增。结果显示，TransGen产品扩增效率较高，可得到漂亮的扩增曲线和标准曲线。

● 无NTC扩增基因数量统计

使用TransGen与Company T的产品，扩增58个基因 (9个人的基因，7个小鼠的基因，17个水稻的基因，8个烟草的基因，4个拟南芥的基因，10个小麦的基因，3个玉米的基因)。无NTC扩增基因数统计。结果显示，TransGen产品无NTC扩增基因数高于Company T，扩增效果更佳。

● 扩增灵敏度

以500 ng的人源RNA反转录(TransGen, AT311)后得到的cDNA为模板梯度稀释，分别使用TransGen与Company T产品扩增β-actin (NTC无扩增 )。结果显示，TransGen产品扩增灵敏度与Company T产品基本一致。

● 不同物种模板扩增

以不同物种的RNA反转录(TransGen, AT311)后得到的cDNA为模板分别使用TransGen与Company T的产品进行扩增(NTC无扩增)。结果显示，TransGen产品扩增效果与Company T产品基本一致。

● 产品稳定性

不同温度保存及反复冻融处理后TransGen产品仍可稳定扩增。

➣ TaqMan探针法

PCR反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针和引物依次退火到模板上进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针，发光基团和淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。

全式金推出的PerfectStart^® II Probe qPCR SuperMix UDG利用在PCR体系中加入荧光探针(TaqMan或Molecular Beacon等)，在扩增过程中其荧光量与扩增产物量成正比，最终通过荧光量的检测测定样本核酸量。

● 产品特点

✼ 3种抗体封闭，特异性高，灵敏度高，扩增效率高。

✼ 特殊优化的qPCR反应缓冲液，可提供更高的灵敏度和特异性。

✼ 使用UDG酶和dUTP，有效防止PCR产物污染，数据准确。

✼ 配有适用于不同机型的Passive Reference Dye (调整PCR加样误差引起的管间差异)，数据准确。

✼ 适用范围广，已成功用于非洲猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、哈维氏弧菌、虾肝肠胞虫和副溶血性弧菌等检测。

✼ 稳定性好，在反复冻融、预混液、常温、37℃等条件下保存，均可稳定扩增。

✼ 提供可冻干版本。

● 多重PCR检测

以牛病毒性腹泻病毒(BVDV) cDNA、猪蓝耳病病毒(PRRSV) cDNA、非洲猪瘟病毒(ASFV)质粒、伪狂犬病病毒(PRV)gDNA混合物为模板，进行qPCR检测。结果表明，TransGen产品可进行4重检测。

● 高灵敏度、高扩增效率

分别以不同浓度猪蓝耳病病毒(PRRSV) cDNA(10 pg、0.1 pg、0.01 pg)及不同浓度牛病毒性腹泻病毒(BVDV) cDNA（100 pg、1 pg、0.1 pg）为模板，使用TransGen、Company V、Company T产品进行qPCR检测。结果表明，TransGen产品灵敏度可达0.1 pg，扩增效果优于Company V与Company T。

● 适用范围广

TranGen产品可成功对不同浓度（107 copies/ml-104 copies/ml，10倍稀释）的哈维氏弧菌、虾肝肠胞虫和副溶血性弧菌DNA进行检测。

● 稳定性好

✼批次稳定性

使用不同批次的TransGen产品进行单重、四重qPCR检测。结果表明，TransGen产品可保障稳定的批次重复性。

✼冻融稳定性

使用5、10、15、20次反复冻融保存处理后的TransGen产品分别进行单重、四重qPCR检测。结果表明，反复冻融后TransGen产品性能不受影响，仍可稳定扩增。

✼预混稳定性（单重）

将单重、双重、三重检测基因的引物探针与TransGen产品进行预混，并在不同温度处理7天后进行qPCR检测，结果表明，TransGen预混液在不同温度保存后仍可稳定扩增。

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