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限制性内切酶常见问题解答

Q:不酶切或酶切不完全

A:

• 酶失活或浓度过低:用已知含目的酶切位点的对照 DNA 测试该酶活性;酶应贮存于 -20℃,-70℃时会冻结;避免反复冻融降低酶活;可根据实验要求适当加大酶

量。

• DNA 浓度不合适:推荐 50 μl 反应体系酶切 1-2 μg DNA;DNA 过量时可适当增加酶量。

• DNA 被抑制剂污染:与对照 DNA 样品一起酶切,验证其是否被抑制;重新纯化 DNA 样品。

• DNA 可能形成超螺旋:不同酶对超螺旋结构 DNA 消化效率不一样,可适当加大酶量。

• 识别位点过于接近 DNA 末端:一般在识别位点两端各加 6 个保护碱基可确保酶切效率。

• 识别位点不存在:验证 DNA 序列。

• 反应条件非最优化:缓冲液使用不当;按比例使用新鲜缓冲液重复实验;按照推荐方案进行双酶切或分步酶切。

• 甲基化封闭酶切位点:PCR 产物未甲基化;使用 dam-/dcm-菌株转化。


Q:出现非预期带型

A:

• 确定正确带型:酶切产物与对照 DNA 样品一起电泳,确定是未消化完的底物条带或者是星号活性产生的非预期条带。

• DNA 样品污染:重新制备或纯化样品

• 含其它酶切位点:验证 DNA 序列


Q:DNA 电泳呈弥散带

A:

• 酶与 DNA 结合紧密未完全解离:使用随酶提供的 DNA Loading Buffer 上样电泳;或另加入终浓度为0.05-0.2% 的 SDS。

• 核酸酶污染:制备新的底物样品;使用新的缓冲液和水。

• 电泳条件不合适:使用新鲜的电泳缓冲液和凝胶;合适的电流电压避免过热。


Q:星号活性 (特异性降低或改变)

A:

• 高甘油浓度 (>5% v/v):酶储存液含 50% 甘油;因此酶量不超过反应体积的10%。选择 50 μl的标准反应体系,以减少反应过程中水的蒸发而提高甘油浓度。

• 非最适缓冲液:尽可能使用推荐缓冲液,离子浓度和 pH 的改变会引起星号活性。

• 存在有机溶剂 ( 如 DMSO、乙醇、DMF 等):确保样品在制备过程中不含任何有机物,如 DNA 制备过程中可能混入的乙醇。

• 混有其它二价离子 (如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 去除样品中二价离子

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